میکروب شناسی پزشکی

2. كليات باكتري شناسي

2.3. ژنتیک باکتری ها

    از دیدگاه ژنتیکی یکی از خصوصیات تمام اشکال حیات، ثبات عمومی یا مشابهت در صفات زاده ها و والدین است. زیرا صفات ارثی در حین انتقال ثابت می مانند. به هر حال علاوه بر توارث صفات که موجب ثبات گونه ها میشود، در زاده ها تغییراتی نیز بروز می کند. این تغییرات با دو خاصیت اصلی سلول یعنی ژنوتیپ و فنوتیپ رابطه دارد. ژنوتیپ عبارت است از ریخت ژنتیکی یک موجود و فنوتیپ عبارت است از تظاهر ژنوتیپ یاخته یا ارگانیسم بصورت صفات قابل مشاهده. تغییرات فنوتیپی ممکن است ناشی از تغییرات در ژنوتیپ باکتری باشد. تغییرات ژنوتیپی به یکی از صورت های کلی زیر ایجاد می شود:

    جهش (موتاسیون = Mutation)

    نوترکیبی (Recombination)

 

جهش

    جهش یا موتاسیون عبارت است از تغییر ردیف نوکلئوتیدهای یک ژن. این تغییر موجب پیدایش یک ژنوتیپ جدید می شود. به اورگانیسمی که آثار جهش را در خود نشان دهد جهش یافته یا موتانت (mutant) گویند. موتاسیون ها وقایعی هستند که به ندرت و بطور اتفاقی می افتند. در جهان باکتری ها از میان یک میلیون تا صد میلیون باکتری، یکی ممکن است دستخوش موتاسیون گردد.

انواع موتاسیون ها

    دو نوع معمول موتاسیون عبارت است از:

    موتاسیون نقطه ای (Point Mutation)

    موتاسیون برهم زننده ي کدها (Frame shift Mutation)

 

موتاسیون نقطه ای:

    اگر در یک ردیف بازهای یک ژن، یک نوکلئوتید خاص جانشین نوکلئوتید دیگر شود، موتاسیون نقطه ای بوجود می آید. در موتاسیون نقطه ای اگر یک باز پورین (مثل آدنین) جایگزین باز پورین دیگری (گوانین) شود و یا باز پیریمدین (تیمین) جای باز پیریمیدین دیگری (سیتوزین) را بگیرد، موتاسیون نقطه ای از نوع Transition است.

    جایگزینی یک پورین به جای پیریمیدین و بالعکس را موتاسیون نقطه ای Transversion می گویند. هر موتاسیون نقطه ای در اثر تغییری که در یک جفت از بازهای یک ژن و معمولا در یکی از رمزهای RNA پیامبر ایجاد می کند، موجب پیدایش یکی از حالات زیر می شود:

    1- باعث ورود یک اسیدآمینه نامربوط (اشتباه) در زنجیره ي پروتئینی می شود و چنین پروتئینی ممکن است در مقایسه با پروتئین طبیعی، کمتر فعال و یا غیر فعال باشد. این نوع موتاسیون را Missence  می نامند.

    2- باعث پیدایش کد اختتام در RNA پیامبر می شود که سنتز پلی پپتیدی کوتاه تر از حد معمول و بنابراین ناقصرا به دنبال دارد. این نوع موتاسیون را Nonsence می نامند.

    3- با آن که یکی از سه نوکلئوتید یک رمز را تغییر می دهد ولی اسیدآمینه نامربوط وارد رشته پروتئینی نمی شود. علت این امر آنست که بعضی از اسیدآمینه ها بیش از یک رمز دارند و لذا رمز تغییر یافته، می تواند یکی دیگر از رمزهای اسیدآمینه ي مربوطه باشد. به این موتاسیون ها، خنثی (Neutral) گفته می شود.

موتاسیون برهم زننده ي کدها:

    اگر به ردیف نوکلئوتید های یک ژن یک نوکلئوتید اضافه شود ویا یک نوکلئوتید کاسته شود، تمام رمزهای موجود در RNA پیامبر به هم می خورد. علت این امر آن است که ترجمه ي رمزها از يك نقطه و در يك جهت مشخص RNA پیامبر ( از رمز AUG ) شروع می شود و به صورت واحد های سه نوکلئوتیدی ( که همان رمزهای اسیدآمینه باشند ) جلو می روند. حال اگر یک نوکلئوتید اضافی در میان رمزها واقع شود، رمزهای بعد از نوکئوتید اضافه شده، به اندازه ي یک نوکلئوتید به جلو کشیده می شود و در نتیجه ماهیت ( نوع ونظم ) همه ي رمزها عوض می شود.

    کم شدن یک نوکلئوتید از ردیف نوکلئوتیدهای یک ژن نیز چنین حالتی را بوجود می آورد. منتهی جهت به هم خوردن نظم رمزها در خلاف جهت قبلی است. این گونه موتاسیون موجب سنتز پروتئین های غیر فعال می شود، چون ردیف کاملا جدیدی از اسید آمینه در پروتئین بوجود می آید.

چگونگی وقوع موتاسیون

    موتاسیون ها در اغلب اوقات به هنگام همانندسازی DNA به وقوع می پیوندند. بعضی از موتاسیون ها حاصل صدماتی است که در اثر پرتوهای ماوراء بنفش و پرتوهای یونیزان به سلول وارد می شود. چون این عوامل از اجزاء لاینفک محیط هستند ( مثلا پرتو ماوراء بنفش از اجزاء نور خورشید است)، احتمالا موجب وقوع بسیاری از موتاسیون های خودبه خودی می باشند.

    با این وصف می توان سرعت وقوع موتاسیون را با استفاده از چنین پرتوهایی افزایش داد. هر عاملی که وقوع موتاسیون را با استفاده از چنین پرتوهایی افزایش دهد موتاسیون زا ( Motagen ) خوانده می شود. موتاسیون هایی که در اثر استفاده عمدی از مواد موتاسیون زا بوجود می آیند، موتاسیون های القایی  Induced Mutation )) نام دارند. موتاسیون های القایی ممکن است از نظر سرعت وقوع با موتاسیون های خودبخودی ( طبیعی ) تفاوت داشته باشند نه از نظر نوع موتاسیون. بعنوان مثال، اشعه ماوراء بنفش هم در شرایط طبیعی ایجاد موتاسیون می کند و هم در شرايط آزمایشگاهی، ولی تعداد موتاسیون در شرایط آزمایشگاهی بیشتر است، چون از دوز قویتر پرتوها استفاده شده است.

   پرتوهای یونیزان همچون اشعه ي ایکس و گاما می توانند با ايجاد یونهای رادیکالی همچون OH و H + ، بسیاری از پیوندهای شیمیایی را تغيير و باعث شکسته شدن زنجیره يDNA شوند. پرتوهای ماوراء بنفش آسیب عمده ي خود را از طریق تشکیل دایمرهای پیریمیدین و بویژه دایمرهای تیمین، وارد می سازنند.

    علاوه بر پرتو های ایکس، گاما و ماوراء بنفش، موادشیمیایی متعددی نیز موجب وقوع موتاسیون می شوند. این مواد را بطور کلی می توان به دودسته تقسیم کرد.

    دسته اول : موادی هستند که بطور شیمیایی با بازهای DNA ترکیب می شوند و موجب تغییر شیمیایی آنها می گردند.«اسید نیترو» که موجب حذف گروه های آمین بازها می شود، مثالی از این دسته مواد شیمیایی به شمار می رود.

    دسته دوم : شبیه بازها هستند. این مواد در DNA جای باز اصلی را می گیرند ولی چون مانند بازهای اصلی نمی توانند پیوندهای هیدروژنی طبیعی تشکیل دهند، موجب پیدایش اشتباهاتی در امر همانند سازی می شوند که به وقوع موتاسیون منجر می شود.

نحوه اصلاح موتاسیون ها

    هر چند که پرتوهایی نظیر پرتو ماوراء بنفش و پرتوهای یونیزان و نیز بعضی از مواد شیمیایی به مولکول DNA آسیب می رسانند، ولی خوشبختانه سلول ها واجد آنزیم هایی هستند که می توانند آسیب های وارده را ترمیم کنند. بسیاری از باکتری ها و مخمرها دارای مکانیسم های تعمیری خاصی هستند که بوسیله نور آبی موجود در طیف نور مرئی فعال می شود و ضایعات حاصله از پرتو ماوراء بنفش را ترمیم می نمایند. این مکانیسم را اصطلاحا«Photoreactivation Mechanism» می گویند. در این مکانیسم، آنزیم خاصی بوسیله ي نور آبی فعال می شود و به دایمر تیمین می چسبد، سپس پیوندهای ایجاد شده بین دو باز را پاره می کند و به این نحو موتاسیون ترمیم می گردد. پس از ترمیم، آنزیم فوق از DNA جدا می شود.

    بعضی از باکتری ها دارای «اگزونوکلئازها» و «آندونوکلئازهای» خاصی هستند که بوسیله ي«آندونوکلئاز» می توانند قطعات آسیب دیده ي DNA را بریده و توسط «اگزونوکلئاز» آن را خارج نمایند. سپس آنزیم دیگری به اسم «DNA پلی مراز» با افزایش نوکلئوتیدهای درست، جای قطعه خارج شده را پر می کند و آنگاه «DNA لیگاز» پارگی ها را به هم متصل می کند.

انواع موتاسیون در باکتری ها

    هر یک از صفات سلول ممکن است توسط جهش تغییر یابد. جهش یافتگان زیادی از میان باکتری ها مجزا شده اند و مورد مطالعه قرار گرفته اند. بعضی از انواع مهم آن ها عبارتند از:

    1- جهش یافتگان مقاوم به داروی سنتتیک یا مقاوم به آنتی بیوتیک، تحمل این موتانت ها نسبت به مواد بازدارنده ي رشد ( داروی شیمیایی یا آنتی بیوتیک ) زیاد است.

    2- جهش یافتگانی که قدرت تخمیر قندهای خاصی در آن ها از بین می رود. مثلا در شرایط معمول، «کلی باسیل»  قادر به تخمیر قند لاکتوز است ولی در نتیجه ي جهش، گاهی نسلی از «کلی باسیل» بوجود می آید که از تخمیر لاکتوز ناتوان است. همچنین جهش یافتگانی که تولید محصولات انتهایی ( End Products) خاصی در آنها افزایش یا کاهش یافته و یا دگرگون شده است. این موضوع در صنعت اهمیت زیادی دارد. بعنوان مثال، در اثر مجزا کردن نوعی کپک پنی سیلیوم جهش یافته، توانسته اند تولید پنی سییلین را به نحو قابل ملاحظه ای افزایش دهند.

    3- جهش یافتگانی که از نظر غذایی ناتوان هستند ، یعنی محیط رشد آن ها باید کامل تر از محیط رشد تیپ وحشی آن ها باشد.

    4- جهش یافتگانی که در اثر جهش آنتی ژن های سطحی آنها، یا شکل کلنی یا قدرت تولید پیگمان در آن ها تغییر نموده است. مثلا کلنی غالب باکتری های گرم منفی پس از خروج باکتری از بدن و رشد در روی محیط کشت، دارای ویژگی صاف و آبدار یا کلنی  S(  Smooth) است. ولی گاهی در نتیجه ي تکرار کشت ( روپیکاژ ) بر روی محیط های مختلف، صفات خشک و خشن یا کلنی R(Roug) را کسب می کند. این تغییرات می تواند در نتیجه ي از دست دادن آنتی ژن پیکری (سوماتیک) ایجاد شود که البته گاهی منشاء محیطی دارد و نه منشاء ژنوتیپی. همچنین استافیلوکوک اورئوس، پیگمان طلایی رنگی می سازد که کلنی را به رنگ زرد در می آورد ولی گاهی در نتیجه ي جهش، این خاصیت باکتری از بین رفته و باکتری دیگر قادر به ساختن ماده ي ذکر شده نخواهد بود. بروز چنین حالتی دائمی است و با حالتی که استافیلوکوک در غیاب هوا قادر به ساختن پیگمان نمی باشد متفاوت است.

    5- موتان هایی که در برابر باکتریوفاژها از خود مقاومت نشان می دهند.

    6- جهش یافتگانی که در آن ها بعضی از خصوصیات مورفولوژیکی، نظیر اسپورزایی، تولید کپسول و یا تاژک، تغییر نموده است.

نو ترکیبی

    نوترکیبی، نتیجه ي انتقال ژن در باکتری هاست. سه نوع انتقال ژن در باکتری ها موجب نوترکیبی ژنی می شود:

 

    ترانسفورمیشن یا انتقال بدون واسطه (Transformation  )

    ترانسداکشن یا انتقال با واسطه ( Transduction )

    کانجوگیشن یا هم یوغی ( Conjugation )

 

ترانسفورميش

    ترانسفورميشن پديده اي است كه طي آن قسمت كوچكي از DNA آزاد شده، از يك ياخته به ياخته ديگر منتقل مي شود. در اثر تجزيه ي طبيعي سلول و يا به طريق شيميايي، مي توان DNA دهنده را از سلول جدا نمود. در انتقال بي واسطه، نوتركيبي هنگامي صورت مي گيرد كه DNA وارد سلول پذيرنده شده باشد. باكتري هايي كه ژن هاي حاوي صفات خاصي را از باكتري دهنده دريافت داشته اند، تغييريافته (Transformed) خوانده مي شوند.

    بنابراين مواقعي كه بعضي از باكتري ها در مجاورت سويه هاي خويشاوند نزديك يا صاف شده ي كشت ( Culture filtrate ) يا عصاره ي آن ها رشد مي كنند،‌يك يا چند صفت ار صفات سويه ي خويشاوند را كسب و در ادامه، به گونه هاي نزديك منتقل خواهند كرد.

   ترانسفورماسيون باكتريايي براي اولين بار توسط گريفت در 1928 توصيف شد. اين اولين كشف مهم در زمينه ي ژنتيك مدرن بود، زيرا نه تنها توصيف كرد كه انتقال ژنتيكي از يك باكتري به باكتري ديگر ممكن است، ‌بلكه در ادامه منجر شد به فهم اين مهم كه ماده ي ژنتيكي فقط DNA است. گريفت براي توصيف ترانسفورماسيون و اثبات انتقال ژنتيكي صفات در باكتري ها، اين آزمايش را انجام داد:

    1-  به گروهي از موش ها، ‌استرپتوكوكوس پنومونيه ي بدون كپسول ( تيپ 2 ) و زنده را تلقيح كرد.

    2- به گروه دومي از موش ها، پنوموكوك كپسولدار ( تيپ 1 ) كشته شده در اثر گرما را تلقيح كرد.

    3- به گروه سوم موش ها، مخلوطي ازارگانيسم هاي بدون كپسول زنده ( تيپ 2) و باكتري هاي كپسول دار كشته شده در اثر حرارت ( تيپ1) را تلقيح كرد.

    بعد از يك تا دو روز گريفت مشاهده كرد كه موش هاي گروه اول و دوم زنده مانده اند و موش هاي گروه سوم در اثر سينه پهلوي پنوموكوكي مرده اند. بعلاوه وقتي گريفت، استرپتوكوكوس پنومونيه را از موش هاي مرده جدا سازي كرد، از نوع « تيپ 1» و زنده بود. با توجه به اين كه پنوموكوك هاي كپسول دار (تيپ 1) قبل از تزريق به داخل موش كشته شده بودند، اين پنوموكوك هاي كپسولدار (تيپ1) ، از كجا آمده بودند؟ تنها پاسخ اين بوده است كه ماده ي ژنتيكي قادر بوده است از ارگانيسم هاي « تيپ 1» كشته شده به داخل اورگانيسم هاي« تيپ 2» گذر كند و اين سلول را به سلول هاي كپسول دار تغيير شكل دهد.

    16 سال بعد، آوري ( Avery )، مك لود (McLeod) و مك كارتي (Mc Carty ) نشان دادند كه عامل اين تغيير،DNA است.

 

 

طبيعت  DNA  در طي ترانسفورماسيون

    وقتي DNA كروموزمي از يك اورگانيسم دهنده خارج مي شود و برهنه مي گردد، ‌كروموزوم مذكور به 200 تا 500 قطعه تقسيم مي شود. باكتري گيرنده قادر است حداكثر 10 تا از اين قطعات را جذب كند. بنابراين مقدار DNAاي كه در هر ترانسفورماسيون دخيل است، به نظر مي رسد در بيشتر موارد، 5-2 درصد كل DNA دهنده است. فقط DNA دو رشته اي قابليت انتقال خواهد داشت.

خصوصيات سلول گيرنده

    باكتري ها فقط در شرايط خاصي قابليت ترانسفورم شدن ( تغيير يافتن ) را دارند. در ارگانيسم هاي گرم مثبت همچون استرپتوكوك و باسيلوس، سلول هاي گيرنده، ساختمان هاي پروتئيني سطحي خاصي را تشكيل مي دهند كه DNA ي در حال انتقال به آن ها جذب شده و مي چسبد. سلول هايي كه توانايي دارند چنين ساختمان هاي پروتئيني خاصي را تشكيل دهند،« كمپتانت » ناميده مي شوند. DNA دو رشته اي به پروتئين هاي قرار گرفته در سطح سلول هاي كمپتانت، اتصال مي يابد و با يك روند وابسته به انرژي به داخل سلول گيرنده منتقل مي شود. پس از ورود DNA، يكي از رشته هاي DNA دهنده متلاشي مي شود. رشته ديگر با قسمت هاي همتايي ( همولوگ ) از كروموزم گيرنده ، ايجاد جفت بازهاي مكمل مي كند و سپس در DNA گيرنده ادغام مي شود. ينابراين DNA جذب شده با ساختمان DNA سلول گيرنده، شباهت و خويشاوندي نزديكي دارد. در غير اين صورت ، DNA به داخل كروموزوم گيرنده الحاق نخواهد شد و در نتيجه بيان نيز نخواهد گشت.

    در باكتري هاي گرم منفي، همچون هموفيلوس و نيسريا نيز ساختمان هاي پروتئيني اختصاصي بر روي سطح خارجي وجود دارد كه به سلول حالت «كمپتانس»  مي دهد. حالت كمپتانس در باكتري هاي گرم منفي باعث مي شود كه هم DNA همولوگ و  هم هترولوگ، به باكتري گيرنده بچسبند. اما ورود DNA بداخل سلول، اختصاص به گونه هاي همولوگ دارد و DNA هترولوگ به داخل راه نمي يابد. بعد از ورود، DNA دو رشته اي فوراً مي تواند بيان شود، اما به منظور بقاء  قطعه DNA اكتسابي جديد در داخل سلول، لازم است كه اينDNA به كروموزوم ميزبان الحاق شود.

 

ترانسداكشن

    براي فهم ترانسداكسيون، ابتدا لازم است كه با باكتريوفاژها آشنا شويم.

    باكتريوفاژ: ويروس هايي هستند كه فقط قادرند در باكتري ها تكثير يابند. هر باكتريوفاژ فقط ميزبان باكتري هاي خاصي است. ساختمان باكتريوفاژ معمولا از دو قسمت اصلي تشكيل شده است(تصویر1-9):

    1- هسته ( Core ): كه از جنس اسيد نوكلئيك است و بوسيله ي يك پوشش پروتئيني به اسم كپسيد  ( Capsid ) پوشانده شده است.

    2- دم ( Tail ): كه از خلال آن، اسيد نوكلئيك خود را به داخل ميزبان تزريق مي كند. دم ممكن است كه در سطح خود، غلاف دمي و در انتهاي خود، رشته هاي دمي را دارا باشد. رشته هاي دمي ( Tail fibers ) باعث اتصال فاژ به گيرنده ي خاصي در سطح باكتري ميزبان مي شوند.

     باكتريوفاژها به دو تيپ عمده ي: 1- ليتيك يا ويرولانت  2- آرام ( Temperate ) يا ليزوژن يا غير ويرولانت تقسيم مي شوند. اگر باكتري توسط يك فاژ ليتيك آلوده شود، فاژ مذكور با به خدمت گرفتن DNA و سيستم آنزيمي باكتري، تعداد زيادي ويروس هاي مشابه خود را همانند سازي و مونتاژ خواهد نمود و در نهايت در اثر كثرت و فراواني ويروس ها، باكتري ميزبان ليز خواهد شد و تعداد زيادي فاژ جديد از آن آزاد مي گردد تا ياخته هاي ديگر را آلوده نمايد. به اين جريان، چرخه ي انهدامي يا چرخه ي ليتيك گفته مي شود. اما اگر يك باکتری توسط فاژ آرام آلوده شود، نتیجه ي امر بزودی مشخص نمي شود. زیرا اسید نوكلئيك ویروس در سلول میزبان الحاق مي شود و از نسلی به نسل بعدی انتقال مي یابد، بدون این که موجبات انهدام سلول فراهم گردد. به ابن حالت، كنورسيون ليزوژني مي گویند. (تصویر 2-9)

    ژنوم فاژ را در این حالت پروفاژ مي نامند. در عین حال ممکن است فاژهاي آرام خودبخود و یا در اثر القاء محیطی، عفونت زا شوند. يعني يكباره ژنوم ویروس الحاق شده در DNA میزبان، بطور خودمختار و بطور پی در پی همانند سازي مي نماید و در ادامه بیان مي گردد و تعداد زيادي كپسيد و دم ویروس حاصل مي آید و در نهایت میزبان خود را منهدم مي نماید.   

 

    ترانسداكسيون ابتدا در سال 1925 توسط «نورتون زيندر» و «جوشواليدبرگ» توصیف شد. این روش، دومین شیوه براي انتقال ماده ژنتيكي از يك باکتری اوليه به يك باکتری ثانویه است. اما در اين روش، DNA برهنه مشابه آن چه در ترانسفورماسيون مشاهده شد، انتقال نمي یابد و بلکه ترانسداكسيون پدیده ای است كه طی آن ژنها بوسیله باكتريوفاژ از يك باکتری به باکتری دیگر انتقال مي یابند.

    وقتي يك باكتريوفاژ ( گاهي فاژ ناميده مي شود ) يك باكتري را آلوده مي كند، فاژ در ابتدا به گيرنده هاي اختصاصي در سطح باكتري جذب مي شود. سپس اسيد نوكلئيك خود را بداخل سيتوپلاسم باكتري تلقيح مي كند، در اين لحظه، بسته به نوع فاژ يكي از دو حالت زير رخ مي دهد:

ترانسداكشن عمومي (Generalized Trans ):

    ممكن است اسيد نوكلئيك فاژ بدون آن كه به داخل ژنوم باكتري الحاق شود، ماشين عمومي باكتري را به خدمت خود بگيرد و آنزيمي را كد گذاري نمايد كه DNA باكتري را به قطعات كوچك تقسيم كند و سپس در جهت سنتز بيشتر اسيد نوكلئيك فاژ و پوشش هاي پروتئيني فاژ عمل كند.

    در طي مراحل مونتاژ يا وصل شدن قطعات مختلف ويروسي به يكديگر، ممكن است قطعه اي از كروموزم باكتريال ميزبان به داخل كپسيد ويروسي وارد شود. چنين فاژهايي كه همراه با ديگر فاژها از باكتري هاي آلوده رها مي شوند از نظر ظاهري مشابه به ذرات فاژ طبيعي هستند. اگر اين فاژ حاوي ژنوم باكتريايي به سطح باكتري ديگر جذب شود، مي تواند محتوي DNA خود را به داخل باكتري پذيرنده تلقيح كند و به اين ترتيب بخشي از اطلاعات ژنتيكي يك باكتري به باكتري ديگر انتقال مي يابد. (تصویر 3-9)

تصویر3-9   ترانسداکشن عمومی

    از آن جا كه در اين نوع ترانسداكسيون، هر بخشي از DNA كروموزومي و نيز DNA غير كروموزومي باكتري ممكن است وارد ذره ويروسي شود و به سلول ديگر انتقال يابد، اين فرايند را با عنوان ترانسداكسيون عمومي مي نامند. فراواني چنين فاژهايي كه به اشتباه ژنوم باكتريايي را در خود جاي مي دهند، حدود 3/0درصد كل فاژهايي است كه در داخل باكتري بسته بندي مي شوند. از آن جا كه مقدار DNA باكتري كه مي تواند در داخل سر يك فاژ بسته بندي شود، فقط حدود 2درصد كل كروموزوم باكتري است، بنابراين  فقط ژن هايي مي توانند در يك  فاژ منفرد، همراه با هم انتقال يابند كه نزديك به هم قرار گرفته اند. با تعيين فراواني ژن هايي كه بصورت همراه با هم انتقال مي يابند مي توان ترتيبشان را در طول كروموزوم باكتري تعيين كرد.

ترانسداكشن محدود(RestrictedTrans ):

    ترانسداكسيون محدود فقط در موقعيت هايي رخ مي دهد كه پروفاژ به داخل يك مكان اختصاصي در كروموزوم ميزبان الحاق مي شود. الحاق فاژ لامبدا ( Phage ) در كروموزوم اشرشياكلي، از اين زمره است. در اين حالت ابتدا  DNAفاژ، يك پروتئين مهاركننده ( Repressor ) را كد و سپس آن را بيان مي كند و به اين وسيله از كپي برداري  DNAفاژ به شكل mRNA پيشگيري مي كند. بنابراين آنزيم تخريب كننده ( قطعه قطعه كننده ) DNAي باكتري ساخته نمي شود. همچنين كپسيدهاي فاژي ساخته نمي شوند و اسيد نوكلئيك فاژ نيز فقط همزمان با همانندسازي DNA باكتري همانند سازي مي شود. در چنين فاژهاي معتدل، گاهي پروتئين ممانعت كننده در پيشگيري از نسخه برداري پروفاژ ناتوان مي شود كه نتيجه ي آن تشكيل ذرات فاژ بالغ است. در توالي معمول در داخل باكتري اشرشياكلي، ژنوم فاژ لامبدا تشكيل يك حلقه مي دهد و از كروموزوم باكتري جدا مي شود. همانند سازي هاي بعدي فاژ و نسخه برداري از DNA فاژ و سنتز تعداد زيادي كپسيد در داخل باكتري، باعث آزادسازي تعداد فراواني اژ لامبداي بالغ مي شود.

    در عين حال حدودا از هر يك ميليون فاژي كه به اين روش توليد مي شوند، در يك مورد نيز اشتباها بخشي از ژنوم باكتري در دو طرف ژنوم فاژ جاي گرفته است. از آنجا كه چنين فاژهايي هنوز مي توانند به داخل كروموزوم اشرشياكلي ديگري الحاق شوند، بنابراين باعث انتقال خصوصيات ژنتيكي باكتري اشرشياكلي اوليه به باكتري اشرشياكلي بعدي خواهند شد. در اين نوع ترانسداكسيون، انتقال ژن هاي باكتري هاي دهنده، محدود به آن ژن هايي مي شود كه در زمان الحاق پروفاژ، در ژنوم باكتري، مجاور پروفاژ بوده اند. بنابراين تعداد ژن هاي مذكور محدود است. به اين جهت به نام ترانسداكسيون محدود ناميده مي شود. 

كانژوگيشن (هم يوغي)

     كانژوگاسيون يا هم يوغي عبارت است از انتقال DNA از يك باكتري دهنده به يك باكتري گيرنده، از طريق تماس مستقيم دو سلول باكتري. كارايي اين مكانيسم در انتقال DNA خيلي بيشتر از ترانسفورماسيون يا ترانسداكسيون است. بعلاوه سلول دهنده در طي فرايند مذكور تخريب نمي شود.

در اين انتقال، سلول هاي دهنده با سلول هاي پذيرنده، از آن جهت متفاوتند كه محتوي يك پلاسميد مي باشند. در كانژوگاسيون ممكن است پلاسميد يا قطعات بزرگي از كروموزوم و در موارد خاصي تمام كروموزوم،از سلول دهنده به سلول گيرنده منتقل گردد.(تصویر4-9)

    پديده ي كانژوگاسيون براي اولين بار در سال 1946 توسط « لدربرگ»        ( Lederberg ) و « تاتوم»                ( Tatum ) نشان داده شد.

     اين دو دانشمند دو سويه از جهش يافتگان اشرشياكلي را كه هر يك توانايي سنتز يك يا چند ماده ي غذايي اساسي را از دست داده بودند، با هم مخلوط نمودند تا بين آن ها تماس فيزيكي برقرار شود. سپس مخلوط حاصل را برروي محيط كشت «حداقل» كه فقط مناسب رشد تيپ وحشي بود كشت دادند. محققين فوق با يافتن كلني هاي تيپ وحشي برروي محيط كشت مذكور، دريافتند كه اين امر بايد حاصل نوتركيبي ژنتيكي از طريق كانژوگاسيون بوسيله سويه هاي  جهش يافته باشد.

پلاسميد ( Plasmid )

    در باكتري ها علاوه بر كروموزوم، عناصر غير كروموزومي از جنس DNA دو رشته اي نيز وجود دارد. به اين عناصر كه قادرند بطور مستقل در سيتوپلاسم باكتري همانندسازي نمايند، پلاسميد مي گويند. پلاسميدها شكل حلقوي دارند و در صورتي كه با اندازه ي كروموزوم باكتري مقايسه شوند، حدود 1/0 تا 5/0 طول كروموزوم مي باشند. پلاسميدها را به دو گروه كلي تقسيم مي كنند. پلاسميدهاي داراي توانايي انتقال خود ( كانژوگاسيون ) و پلاسميدهاي فاقد توانايي انتقال. بطوركلي، پلاسميدهاي فاقد توانايي انتقال، كوچك هستند ( 20-3 ميليون دالتون ) و به تعداد زياد ( 60-10 كپي ) در داخل سلول باكتري حضور دارند. اين پلاسميدها داراي قدرت همانندسازي هستند و همانندسازي آن ها بيش از همانندسازي كروموزوم رخ مي دهد.

    در مقابل، پلاسميدهاي قادر به انتقال خود، بزرگ هستند ( 100-40 ميليون دالتون ) و توسط آنزيم هاي مشابهي با همانندسازي كروموزوم تكثير مي يابند. تعداد آن ها در سلول معمولا به تعداد 3-1 كپي است و همزمان با كروموزوم همانندسازي مي كنند. چنين پلاسميد هايي مجموعه اي از ژن ها به نام ژن هاي tra را حمل مي كنند كه كد كننده ي پيلي جنسي و آنزيم هاي انتقال دهنده ي DNA مي باشند. ژن هاي tra در پلاسميدهاي فاقد توانايي انتقال، وجود ندارند. 

    پلاسميدها كد کننده ي اعمالی هستند كه لازمه ي حيات سلول نيست، اما قابليت هاي متابوليكي مفيدي را براي سلول مهيا مي كنند. پلاسميدها در طبيعت بطور وسيع پراكنده اند و غالب باكتري هاي جدا شده از موارد باليني، محتوي حداقل 1 و اغلب 6 پلاسميد مختلف هستند. آن ها، هم در باكتري هاي گرم مثبت و هم گرم منفي وجود دارند و بر حسب اعمالي كه كد مي كنند طبقه بندي مي شوند. پلاسميدها ممكن است حاوي ژن هاي مقاومت به نمك هاي جيوه و نقره باشند. يا كد كننده ي آنزيم هايي باشند كه در هنگام تابش پرتو ماوراء بنفش، نقش تعمير كننده ي DNA را دارا است. همچنين توليد پيلي و فيمبريه نيز توسط پلاسميد كد مي شود. توليد هموليزين در اشرشياكلي، آنترتوكسين مسئول اسهال و خيلي از اگزوتوكسين هاي ديگر، همچون توكسين مسئول بوتوليسم، كزاز و تب مخملكي، توسط پلاسميدها كد مي گردند.

    ويژگي هاي ديگر، مثل توانايي تثبيت ازت در باكتري« ريزوبيوم » و توانايي تجزيه ي مولكول هاي نفت در بعضي از « پسودوموناس »ها نيز در ساختمان پلاسميد كد گذاري شده است. پلاسميد بعضي از باکتری ها، عوامل باكتريوسينوژنيك (Bacteriocinogenic) هستند، يعني ساختمان پروتئين هايي را هدايت مي كنند كه موجب مرگ ديگر باكتري هاي همگونه يا گونه هاي نزديك مي شوند. اين پروتئين ها را به طور كلي، باكتريوسين (Bacteriocine) مي خوانند. باكتريوسين اشرشياكلي را«كلي سين»(Colicine) و باكتريوسين گونه هاي پسودوموناس را« پيوسين» (Pyocine) مي نامند. عامل R كه موجب مقاومت بعضي از باكتري ها در مقابل تعدادي از آنتي بيوتيك ها مي شود، نيز جزء پلاسميدها به حساب مي آید. بعضی از عوامل R مي توانند از طريق كانژوگاسيون به سلول هاي ديگر منتقل شوند. پلاسميدها همچنين ممکن است هیچ يك از اعمال متنوعی كه براي بقاي باكتري كمك كننده است را كد نكنند اما همه ي آن ها حداقل داراي توانايي همانندسازي خودشان هستند.

    كاسميد (Casmid):از ادغام ژنوم باكتريوفاژ و پلاسميد حاصل مي شود و در نوتركيبي ژنتيكي كاربرد بسيار دارد.

انتقال پلاسميد

    كانژوگاسيون يك فرايند يك طرفه است و برخلاف سلول هاي يوكاريوت، نتيجه ي به هم پيوستگي كامل دو سلول براي تشكيل سلول هاي  ديپلوئيد نيست. در كانژوگاسيون،  باكتري دهنده، محتوي يك پلاسميد است كه داراي« 25-15»  ژن اوليه ي انتقال پلاسميد مي باشد و چنانچه گفته شد، به نام ژنهای tra نامیده مي شوند و مخصوص انتقال پلاسميد هستند، يعني ساختمان ها و آنزيم هاي مورد نياز جهت وقوع كانژوگاسيون را كد مي کنند. يكي از ساختمان هاي ضروري كد گذاري شده توسط ژن هاي tra، پيلي جنسي است.

    در هر سلول دهنده، بين «10-3»  پيلي جنسي وجود دارد. قطعه اي از پلاسميد كه حاوي ژن هاي tra مي باشد به نام فاكتور جنسي (F- Factor) ناميده مي شود و هر باكتري كه در سيتوپلاسم خود داراي پلاسميد حاوي فاكتور F باشد، باكتري نر ناميده مي شود و با F+ نشان داده مي شود. سلول هايي كه در فرايند كانژوگاسيون گيرنده يDNA  هستند، با علامت -F  نشان داده مي شوند. اين سلول ها فاقد پلاسميد حاوي فاكتور F مي باشند.

 

پلاسميد طي مراحل زير به باكتري گيرنده انتقال مي يابد :

    1- پيلي جنسي با يك گيرنده كه بر روي سطح سلول پذيرنده وجود دارد، واكنش مي كند.

    2- در اثر تحريك حاصل از تماس با سلول گيرنده،  پيلي جنسي به داخل سلول دهنده پس زده مي شود و در نتيجه سلول دهنده را در تماس نزديك با سلول گيرنده قرار مي دهد.

    3- يك نوكلئاز توسط ژن پلاسميدي tra سنتز مي شود. اين نوكلئاز حلقه يDNA پلاسميد را در يك مكان خاصي كه نقطه ي شروع انتقال است، مي شكند.

    4- سپس انتهاي 5َ آزاد زنجيره ي پلاسميد باز شده و در داخل پيلي جنسي به سمت سلول گيرنده كشيده مي شود و احتمالا در اين مسير توسط ديگر آنزيم هايي كه توسط ژنهاي traكد مي شوند هدايت مي گردد.

    5- زنجيره  ي DNA انتقال يافته و زنجيره يDNA باقیمانده در سلول دهنده، بطور طبيعي توسط آنزيم DNA پلي مراز سلول  همانندسازي مي شوند و در نتيجه كپي هاي حلقوي دو رشته اي در هر دو سلول ایجاد مي كنند.

    6- به دنبال انتقال DNA، پل ارتباطی تخريب مي شود و دو سلول جدا مي شوند.حال ژن هاي tra در سلول پذيرنده بيان مي شوند. بنابراين آن سلول نيز اينك يك سلول دهنده ( سلول  F+ ) مي باشد.

    با روش فوق، پلاسميدها به سرعت در داخل جمعیت هاي باكتريايي گسترش مي يابند.

    برخلاف ترانسفورماسيون و ترانسداكسيون كه انتقال و بيان DNA ، فقط در بين ارگانيسم هاي كاملا نزديك به هم رخ مي دهد، انتقال پلاسميد توسط كانژوگاسيون از اختصاصات خيلي كمتري برخوردار است. در حقیقت بعضي پلاسميدهاي ميزبان مي توانند خودشان را به گونه هاي خيلي متفاوت انتقال دهند.

 

انتقال كروموزوم

    چنانچه گفته شد، كانژوگاسيون بين سلول F+ و سلول-F، باعث انتقال سريع پلاسميد حاوي فاكتور F به سلول F-مي شود و آن را به سلول F+ تغيير مي دهد. با اين وجود در موارد نادر پلاسميد F يك باكتري به كروموزوم همان باكتري الحاق مي شود. چنين سلول هايي قادرند كروموزوم خود را در اين شرايط انتقال دهند. اين سلول هاي دهنده را به نام  High Frequency of Recombination ( HFR ) مي نامند، زيرا انتقال چنين كروموزوم هايي با نوتركيبي فراوان در سلول گيرنده همراه است. انتقال كروموزوم از باكتري HFR، از مكاني كه فاكتور F الحاق شده است و بلافاصله بعد از آن آغاز مي شود. يكي از رشته هاي DNA كروموزوم باز مي شود و همزمان انتقال مي يابد. انتقال تمام كروموزوم به حدود 120 دقيقه وقت نياز دارد. اما انتقال كروموزوم معمولا کامل نيست و احتمال اين كه يك ژن مشخص انتقال يابد وابسته به فاصله ي آن ‍ژن تا مكان شروع انتقال، مي باشد. هرچه اين ژن از مكان انتقال كروموزومي دورتر باشد، انتقال آن به زمان بيشتري نياز دارد. ژن هاي tra كه الحاق کننده ي فاکتور F در كروموزوم هستند، آخرين ژن هايي مي باشند كه انتقال مي يابند. معمولا قبل از انتقال تمامی ژنوم، كانژوگاسيون در اثر تصادف گسسته مي شود. بنابراين ژن هاي انتهايي باكتري HFR به ندرت انتقال مي يابند. چون براي تبديل  -F به HFR،انتقال تمام ژن هاي tra (فاكتور F ) لازم است، به همين دليل پس از كانژوگاسيون، اغلب باکتری های گيرنده ي كروموزوم HFR، كماكان بصورت  F-باقي مي مانند.(تصویر7-9)

                                  HFR × F-  F-

 

    بطور خلاصه، در لقاح بين باكتري HFR و باكتري F-، فراواني انتقال فاكتور F بسيار كم است ولي نوتركيبي حاصل بسيار بالاست. برعكس در لقاح بين باكتري F- و F+، فراواني انتقال فاكتور F           « 100% » و فراواني نوتركيبي بسيار اندك است ( يك نوتركيبي در105- 104 باكتري )، زيرا در اين نوع لقاح، انتقال فقط شامل انتقال پلاسميد است و نه كروموزوم . چون پلاسميد تعداد ژن محدودي دارد، بنابراين طبيعي است كه فراواني نوتركيبي هاي حاصل كم خواهد بود.

تعيين نقشه ي ژنتيكي با كمك كانژوگاسيون

    نظم انتقال كروموزوم از باكتري HFR به باكتري F- را مي توان از طريق گسستن آميزش تعيين نمود. براي اين منظور ابتدا باكتري هايHFR و F- را باهم مخلوط مي كنند ، سپس در زمانهاي مختلف و با استفاده از به هم زدن، در امر كانژوگاسيون گسستگي ايجاد مي كنند ( ارتباط فيزيكي دو سلول را قطع مي كنند )، سپس سلول ها را در محيط هاي كشت انتخابي سفت رشد مي دهند تا نوتركيبي هايي كه قبل از ايجاد گسستگي بوجود آمده اند مشخص شوند. با تعيين فراواني نوتركيبي ژن ها و مشخص كردن زمان انتقال هر ژن به باكتري F-، مي توان نقشه ي ژنتيكي كروموزوم HFR را تعييين نمود. بايد دانست، اين امر به آن علت امكان پذير است كه كروموزوم HFR، عليرغم حلقوي بودن، به طريقه ي خطي به F- انتقال مي يابد. اين بدان معني است كه عامل F- ادغام شده در كروموزوم، نه تنها نقش گشودن حلقه كروموزوم را دارد، بلكه قسمتي از آن بعنوان مبداء انتقال DNA عمل مي كند.

سلولهاي َF   

    پلاسميد مي تواند در داخل كروموزوم الحاق شود و مجدد در هنگام ضرورت، فرايند معكوس رخ دهد و پلاسميد از كروموزوم خارج شود. در صورتي كه هنگام خارج شدن پلاسميد از كروموزوم، جدا شدن بطور غير طبيعي انجام شود، ممكن است بخشي از ژن هاي كروموزوم كه در زمان الحاق پلاسميد در يك يا هر دو سمت پلاسميد قرار گرفته اند نيز به همراه پلاسميد از كروموزوم جدا شوند. چنين پلاسميد هايي به نام پلاسميد َF اوليه نامیده مي شود.

    پلاسميد َF نيز مي تواند به همان سرعت پلاسميد F+، به دیگر باکتری ها انتقال يابد. در صورت انتقال، چنين پلاسميدي به نام پلاسميد َF ثانویه ناميده مي شود. بنابراين تشكيل پلاسميدَF ، روش ديگري براي پراکنده شدن ژن هاي كروموزومي در جمعيت هاي باكتريايي مي باشد.

كانژوگاسيون در باكتري هاي گرم مثبت

    كانژوگاسيون همچنین در بعضی از باكتري هاي گرم مثبت رخ مي دهد. اما به نظر مي رسد مکانیسم آن از آن چه در باكتري هاي گرم منفی اتفاق مي افتد متفاوت است. شواهدی براي حضور پيلي جنسی وجود ندارد، در عوض سلول هاي دهنده با شناسايي يك « فرومون» كه توسط سلول هاي پذیرنده ي مناسب تولید شده است، تحريك مي شوند و يك ماده ي چسبنده تولید مي كنند. ماده ي چسبنده باعث اتصال سلول هاي دهنده و پذیرنده مي شود و انتقال DNA رخ مي دهد. در عین حال مکانیسم اين نوع انتقال روشن نیست.